Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm

Để đảm bảo an toàn thực phẩm cần phải có phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm. Bài viết này sẽ phân tích sơ về điểm mạnh và hạn chế của một số phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm đang được sử dụng phổ biến hiện nay.

HIỂU RÕ VỀ KHÁI NIỆM VI SINH THỰC PHẨM

Vi sinh thực phẩm hay nói đúng hơn là vi sinh vật (VSV) gây bệnh hiện diện trong thực phẩm. VSV gây bệnh hiện diện trong thực thực phẩm ở nhiều trạng thái khác nhau và vấn đề đầu tiên là cần phải hiểu rõ trạng thái nào sẽ có nguy cơ gây mất an toàn thực phẩm.

1. – Trạng thái sống (viable) là VSV còn sống và có khả năng tăng sinh trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc có khả năng phát triển tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch nuôi cấy.

2. – Trạng thái tổn thương (injured) là VSV bị tổn thương về mặt cấu trúc hoặc chức năng do các yếu tố vật lý, hóa học trong quá trình chế biến thực phẩm gây ra. Những VSV này thường không thể tăng sinh trên các môi trường chọn lọc, nếu thời gian đủ lâu hoặc điều kiện phù hợp chúng sẽ phục hồi về dạng sống.

3. – Trạng thái sống nhưng không thể nuôi cấy (VBNC) là VSV bị mất khả năng tăng sinh trên môi trường nuôi cấy, những VSV này vẫn có thể phục hồi về dạng sống nếu gặp điều kiện phù hợp. Dù vậy chúng vẫn còn sống nên vẫn biểu hiện gene và protein, vì vậy có thể phát hiện thông qua các hoạt động trao đổi chất.

4. – Trạng thái “nằm vùng” (persister) là VSV thay đổi điều kiện tăng sinh do được phơi nhiễm với kháng sinh hoặc một hóa chất nào đó trong suốt một thời gian dài, những VSV này không còn khả năng tăng sinh trong môi trường bình thường nữa mà bắt buộc phải có sự hiện diện của hóa chất mới có thể tăng sinh bình thường.

5. – Trạng thái ngủ đông (dormant) là VSV trong trạng thái không tăng sinh cũng chẳng trao đổi chất, ở trạng thái này VSV không thể hiện bất kỳ dấu hiệu nào của sự sống, dù vậy chúng vẫn có thể sống lại bất cứ lúc nào. Bào tử (spore) chính là một trong những trạng thái ngủ đông phổ biến.

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

1. Phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy thường được xem là “tiêu chuẩn vàng” (gold standard) trong phân tích vi sinh thực phẩm. Phương pháp nuôi cấy truyền thống dựa trên khả năng tăng sinh tạo khuẩn lạc của vi khuẩn trong môi trường phòng thí nghiệm (Hình 1). Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy là nhạy, rẻ và dễ thực hiện, cung cấp thông tin về chất lượng, số lượng và cả chủng loại vi sinh vật sống hiện diện trong thực phẩm.

Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp nuôi cấy là rất tốn thời gian. Để có thể phát hiện được vi sinh thực phẩm cần phải thực hiện rất nhiều bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và rồi còn phải tái xác nhận lại bằng các kiểm nghiệm sinh hóa và huyết thanh. Thông thường cần tốn khoảng 1 tuần để thực hiện toàn bộ quy trình trên và định danh được vi sinh vật.

Chưa kể, sự phân bố không đồng đều của vi sinh trong mẫu và sự hiện diện của các vi sinh bản địa có thể làm ảnh hưởng đến độ đặc hiệu và tính chính xác của quy trình nuôi cấy. Không chỉ có vậy, phương pháp nuôi cấy gặp nhiều hạn chế nếu VSV trong mẫu thực phẩm ở trạng thái tổn thương hoặc VBNC.

2. Phương pháp không nuôi cấy

Chính vì hạn chế về thời gian của phương pháp nuôi cấy, các phương pháp xét nghiệm vi sinh thực phẩm không nuôi cấy đã ra đời. Trong đó 2 nhóm phương pháp dựa trên nucleic acid và dựa trên thực khuẩn thể (bacterio phage) được đánh giá là có nhiều tiềm năng và hứa hẹn sẽ có thể thay thế phương pháp nuôi cấy truyền thống.

a) Phương pháp dựa trên nucleic acid nhắm đến việc phát hiện DNA/RNA của VSV gây bệnh. Phổ biến nhất trong nhóm này là các phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR, ưu điểm của các phương pháp này là nhanh chóng, nhạy và đặc hiệu. Dù vậy do mục tiêu là DNA/RNA nên kết quả dương tính có thể là do xác VSV, vì vậy các nhà khoa học đã phải cải tiến kỹ thuật PCR bằng cách kết hợp sử dụng các thuốc nhuộm tế bào sống, phương pháp này được gọi là “viability PCR” (vPCR) (Hình 2).

Trong phương pháp vPCR, đầu tiên tế bào sẽ được nhuộm với ethidium monoazide (EMA) hoặc propidium monoazide (PMA). Các chất như EMA và PMA sẽ bám vào DNA, tuy nhiên chúng không thể xuyên qua lớp màng tế bào nguyên vẹn nên chỉ có thể bám vào DNA của tế bào có lớp màng không còn nguyên vẹn.

Khi được chiếu sáng, các đoạn DNA bị bám bởi EMA hoặc PMA sẽ bị tổn thương không thể phục hồi dẫn đến ức chế mạnh mẽ phản ứng PCR. Không chỉ có PCR, cả các kỹ thuật qPCR và LAMP cũng có thể sử dụng EMA hoặc PMA để phân biệt tế bào sống với tế bào chết theo nguyên lý tương tự.

Dù vậy, kỹ thuật vPCR chỉ dựa trên tính toàn vẹn của màng tế bào nên phát hiện các tế bào trạng thái tổn thương không hiệu quả (âm tính giả) và lại cho tín hiệu PCR với các tế bào đã bất hoạt (dương tính giả). Hơn nữa, trong một số giai đoạn sinh trưởng thì thành tế bào vi khuẩn cũng bị đục lỗ một cách tự nhiên nên nếu mẫu được lấy ở các giai đoạn này sẽ cho kết quả không chính xác (âm tính giả).

Phương pháp RT-PCR cũng được đưa vào sử dụng nhằm phát hiện “tế bào sống” thông qua sự hiện diện của RNA thông tin (mRNA), mRNA là bằng chứng cho hoạt động sinh tổng hợp của tế bào. Trong kỹ thuật RT-PCR, mRNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA (giai đoạn RT) rồi sau đó được khuếch đại nhờ phản ứng PCR. Dù vậy, kỹ thuật RT-PCR không thật sự được ưa chuộng trong xét nghiệm vi sinh thực phẩm, một phần có thể là do mRNA dễ bị phân hủy nên dễ gây ra âm tính giả.

b) Phương pháp dựa trên bacterio phage là đề xuất cực kỳ thú vị cho xét nghiệm vi sinh thực phẩm, bởi vì phage xâm nhiễm trên vi khuẩn một cách cực kỳ đặc hiệu và hiệu quả. Không chỉ có vậy, phage chỉ xâm nhiễm trên vi khuẩn còn sống, vô tình điều này đã giải quyết hầu hết các thách thức trong xét nghiệm vi sinh thực phẩm.

Xét nghiệm vết tan (plaque assay): là phương pháp xét nghiệm đơn giản dựa trên khả năng ly giải tế bào vi khuẩn của phage. Trong phương pháp này mẫu sẽ được ủ với phage, sau đó sử dụng chất diệt virus (chemical virucide) hoặc xử lý bằng phương pháp vật lý để tiêu diệt toàn bộ các phage ngoại bào. Ngay trước thời điểm bùng phát, mẫu sẽ được pha loãng ở nồng độ thích hợp và nuôi cấy trải trên đĩa thạch mềm cùng với vi khuẩn chỉ thị. Vi khuẩn chỉ thị có thể là bất kỳ vi khuẩn nào, miễn là chúng sinh trưởng nhanh và có khả năng nhiễm loại phage đang sử dụng.

Đến thời điểm bùng phát, phage sẽ thoát khỏi tế bào trong mẫu và nhiễm vào các tế bào vi khuẩn chỉ thị xung quanh và sau khoảng 1 ngày ủ thì trên đĩa thạch sẽ xuất hiện những vết tan (plaque). Mỗi một vết tan được gọi là 1 PFU, chỉ số PFU/mL mẫu đại diện cho nồng độ vi khuẩn trong mẫu ban đầu (Hình 3).

Điểm mấu chốt quyết định thành công của phương pháp xét nghiệm vết tan (plaque assay) là bước tiêu diệt các phage ngoại bào, nếu bước này không được xử lý tốt sẽ dẫn đến tình trạng dương tính giả. Để khắc phục tình trạng này, sau bước xử lý bằng chất diệt virus cần thêm một bước PCR để kiểm tra sự hiện diện của phage trong dịch ngoại bào trước khi đem mẫu đi nuôi cấy trên đĩa thạch mềm. Điều này khiến quy trình vốn đã khá mất thời gian (hơn 1 ngày) càng trở nên phức tạp nên vẫn cần được nghiên cứu cải tiến nhiều hơn để có thể áp dụng rộng rãi trong phòng kiểm nghiệm.

Xét nghiệm bằng qPCR/miễn dịch: là phương pháp xét nghiệm phát hiện những phage mới được tạo ra sau khi xâm nhiễm và ly giải tế bào chủ vi khuẩn.

Trong phương pháp xét nghiệm miễn dịch, mẫu sẽ được ủ với một lượng phage dưới ngưỡng phát hiện của các bộ kit miễn dịch. Sau một thời gian nhất định, đem mẫu đã ủ đi xét nghiệm miễn dịch, nếu kết quả ra dương tính chứng tỏ phage đã tăng sinh và vượt ngưỡng phát hiệt của bộ kit.

Phương pháp qPCR cũng sử dụng nguyên lý tương tự, phage bị cố định trên bề mặt vàng, silica hoặc cellulose đã biến đổi sẽ tiếp xúc với mẫu để gây nhiễm, mẫu sau khi được gây nhiễm sẽ chuyển sang môi trường nuôi cấy hoàn toàn mới để ủ tăng sinh. Sau một thời gian nhất định, dịch môi trường sẽ được thu nhận để thực hiện phản ứng qPCR phát hiện bộ gene của phage mới vừa hình thành.

Các phương pháp này có thể phát hiện phage chỉ sau một hoặc một vài chu kỳ ly giải tế bào, vì vậy rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống còn từ 4 đến 8 giờ. Nghiên cứu cũng cho thấy phương pháp miễn dịch kém nhạy hơn so với qPCR một ít.

Xét nghiệm bằng enzyme – cơ chất: là phương pháp giúp phát hiện những thành phần nội bào phóng thích ra ngoài môi trường thông qua sự phát quang sinh học từ phản ứng giữa enzyme với cơ chất. Có 3 cách phổ biến để phát hiện sự ly giải tế bào:

– Phát hiện các marker nội bào có thể là adenosine-5 triphosphate, ATP, β-galactosidase.

– Phát hiện sự tăng sinh của phage dựa trên luciferase, protease, alkaline phosphatase.

– Phát hiện sự thay đổi độ dẫn điện của môi trường do các chất điện giải nội bào được phóng thích vào môi trường.

KẾT LUẬN

Mỗi phương pháp xét nghiệm vi sinh thực phẩm đều có những ưu điểm và hạn chế nhất định. Phương pháp nuôi cấy vốn được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong kiểm nghiệm vi sinh vẫn gặp khó khăn đối với VSV ở trạng thái sống nhưng không thể nuôi cấy, ngoài ra thời gian trả kết quả kiểm nghiệm cũng rất lâu. Vì vậy các phương pháp không nuôi cấy vẫn đang được nghiên cứu và phát triển để thay thế cho phương pháp nuôi cấy truyền thống, trong đó hiện tại có 2 nhóm phương pháp được quan tâm nhiều nhất đó là nhóm phương pháp xét nghiệm dựa trên nucleic acid (DNA/RNA) và nhóm phương pháp xét nghiệm dựa trên bacteriophage.

Sơn Phạm  – Lược dịch và tổng hợp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Anany, H., Brovko, L., El Dougdoug, N. K., Sohar, J., Fenn, H., Alasiri, N., … & Filipe, C. D. (2018). Print to detect: a rapid and ultrasensitive phage-based dipstick assay for foodborne pathogens. Analytical and bioanalytical chemistry, 410(4), 1217-1230.

Fittipaldi, M., Nocker, A., & Codony, F. (2012). Progress in understanding preferential detection of live cells using viability dyes in combination with DNA amplification. Journal of microbiological methods, 91(2), 276-289.

Foddai, A. C., & Grant, I. R. (2020). Methods for detection of viable foodborne pathogens: current state-of-art and future prospects. Applied Microbiology and Biotechnology, 1-8.

Stambach, N. R., Carr, S. A., Cox, C. R., & Voorhees, K. J. (2015). Rapid detection of Listeria by bacteriophage amplification and SERS-lateral flow immunochromatography. Viruses, 7(12), 6631-6641.