PCR là gì, ứng dụng của PCR trong lĩnh vực y học hiện đại

PCR là một kĩ thuật được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghệ sinh học, kĩ thuật này đã mang lại giải Nobel về Hóa học năm 1993 cho người phát minh ra nó – Kary Banks Mullis. Sau hơn 30 năm hình thành và phát triển, ngày nay kĩ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: sinh học, y học, tội phạm học, xác định huyết thông,… Và gần đây kĩ thuật PCR được biết đến rộng rãi nhờ vào việc ứng dụng xét nghiệm phát hiện virus SARS-CoV-2. Hãy cùng chúng tôi tìm hiểu rõ hơn về kĩ thuật PCR thông qua bài viết này.

1. Kỹ thuật PCR là gì? (Polymerase chain reaction – Phản ứng chuỗi polymerase).

PCR là gì

? PCR là viết tắt của thuật ngữ Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại invitro phân tử DNA hoặc đoạn phân tử DNA chọn lọc, làm tăng số lượng DNA ban đầu lên một lượng mong muốn.

Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kì, mỗi chu kì gồm 3 bước: biến tính DNA khuôn để tách mạch đôi, bắt cặp giữa mồi và trình tự bổ sung trên khuôn DNA, kéo dài mồi và tổng hợp đoạn DNA bổ sung theo chiều 5’-3’. Sau khi kết thúc một chu kì, bắt đầu một chu kì mới bằng bước biến tính.

Bước 1

Biến tính bằng cách tăng nhiệt độ lên 94-96 °C để phá vỡ liên kết hydrogen nối 2 sợi DNA khuôn, tách chúng thành 2 mạch đơn của DNA khuôn.

Bước 2

Sau khi 2 mạch DNA tách khỏi nhau hoàn toàn, nhiệt độ được hạ thấp xuống để tiến hành bước gắn mồi, mồi sẽ gắn vào sợi DNA đơn và tổng hợp mạch bổ sung theo chiều 5’-3’. Nhiệt độ của giai đoạn gắn mồi chủ yếu phụ thuộc vào đoạn mồi được sử dụng, thông thường sẽ thấp hơn giai đoạn biến tính khoảng 50°C (45-60°C). Nếu có sai lệch về mặt nhiệt độ ở giai đoạn này sẽ dẫn đến việc mồi sẽ không gắn hoàn toàn vào sợi DNA khuôn, hoặc gắn một cách tùy tiện sẽ gây ra các đột biến điểm không mong muốn.

Bước 3

Bước này gọi là bước kéo dài. DNA polymerase gắn tiếp vào cạnh đoạn mồi và hoạt động dọc theo sợi DNA và tổng hợp đoạn bổ sung theo chiều 5’-3’. Nhiệt độ bước này phụ thuộc DNA polymerase. Thời gian sẽ phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài sợi DNA cần khuếch đại.

Trong vòng một giờ, sự khuếch đại có thể đạt đến 1 triệu lần, DNA được khuếch đại có thể phát hiện bằng các phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp thường gặp nhất là điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethydium bromide. Hiện nay, để đạt được độ chính xác cao về định tính và cả định lường đồng thời tiết kiệm thời gian thao tác, người ta có thể sử dụng các thiết bị hiện đại thay thế như máy Realtime PCR.

Chắc hẳn các bạn đã hiểu rõ

PCR là gì

qua phần trình bày trên rồi. Bây giờ, mời các bạn tiếp tục tìm hiểu ứng dụng của kỹ thuật PCR trong y học .

2. Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong y học và các lĩnh vực liên quan.

Từ một lượng DNA rất nhỏ như: giọt máu, sợi tóc, hoặc tế bào,… thông qua kĩ thuật PCR người ta có thể khuếch đại chính xác và trật tự một lượng lớn DNA mục tiêu nhằm phục vụ cho mục đích thí nghiệm như lập bản đồ gen, phát hiện gen, phát hiện đột biến điểm, dòng hóa gen, giải mã trình tự DNA,…
 

Với những mục đích thí nghiệm kể trên, hiện nay PCR được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học: chuẩn đoán, tầm soát bệnh ung thư (phát hiện HPV trong ung thư cổ tử cung, tìm gen BRCA1-BRCA2 trong tầm soát ung thư vú, Phát hiện gan APC trong ung thư đại tràng,…), phát hiện hồng cầu hình lưỡi liềm bằng cách phát hiện đột biến điểm tại vị trí CvnI,  nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen), phát hiện các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…), các virus (viêm gan B, viêm gan C, HIV, Herpes, H5N1, SARS,..).
 

Kỹ thuật PCR cũng được dùng để xác định độc tố của vi sinh vật: sử dụng nhiều cặp mồi VT1-F, VT1-R , VT2-F, VT2-R, eae-F, eae-R để phát hiện các gen VT1, VT2 và eae của vi khuẩn V erotoxigenic E.coli (VTEC) có khả năng sinh độc tố Verotoxin hoặc Shigalike toxin gây hại cho đường ruột. Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT – cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT (cholera toxin – độc tố ruột của vi khuẩn tả) giúp phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả.

3. Phát hiện lây nhiễm Covid 19 bằng xét nghiệm RT-PCR.

Biến tính bằng cách tăng nhiệt độ lên 94-96 °C để phá vỡ liên kết hydrogen nối 2 sợi DNA khuôn, tách chúng thành 2 mạch đơn của DNA khuôn.Bước này gọi là bước kéo dài. DNA polymerase gắn tiếp vào cạnh đoạn mồi và hoạt động dọc theo sợi DNA và tổng hợp đoạn bổ sung theo chiều 5’-3’. Nhiệt độ bước này phụ thuộc DNA polymerase. Thời gian sẽ phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài sợi DNA cần khuếch đại.

Đầu tiên, chúng ta cần nắm rõ khái niệm virus corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2. Viết tắt SARS-CoV-2, đây là một virus có hệ gen là một RNA sợi đơn. Sau khi thu dịch phết hầu họng của người nghi nhiễm. Kĩ thuật viên sẽ sử dụng một enzyme sao chép ngược là Reverse Trancriptase (RT) để biến đổi RNA của virus thành cDNA và tiến hành kỹ thuật PCR..

RT-PCR là gì

 
RT- PCR là gì? Đây là kỹ thuật Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction. RT- PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử cho phép đọc được tín hiệu trong mẫu (nếu có) theo thời gian thực (realtime). Kĩ thuật gồm 2 giai đoạn:  (1) tổng hợp cDNA từ RNA virus bằng ezyme sao chép ngược, (2) khuếch đại cDNA bằng kĩ thuật PCR chính thống.
 

Nếu trong mẫu có RNA của virus thì sau một số chu kỳ khuếch đại nhất định. Tín hiệu trong mẫu sẽ vượt tín hiệu nền và được thiết bị Realtime PCR ghi nhận, gọi là CT (Cycle threshold) của mẫu. Giá trị CT thể hiện số chu kì mà virus SARS-CoV-2 bị phát hiện. Số chu kì chuẩn sẽ được cài đặt và được ghi lại tính hiệu trong suốt quá trình thiết bị Realtime PCR thực hiện xét nghiệm.

Ý nghĩa của CT trong kết quả test virus Sars-Cov2

Tải lượng virus, thể hiện qua chỉ số CT: khi mới nhiễm thì CT cao do lượng virus thấp. Sau đó CT giảm dần (lượng virus tăng mạnh). Tiếp theo đó, CT lại cao lên (lượng virus giảm xuống). Khi điều trị, bệnh nhân sẽ được xuất viện khi chỉ số CT>=30. Tức là người đó đã có tải lượng virus rất thấp, khó lây nhiễm cho người xung quanh. Khi chỉ số CT tiếp tục tăng đến trên 33 thì được xem là không thể lây được nữa. Tuy nhiên, tốc độ thải virus ở mỗi người bệnh mỗi khác nhau. Nên thời gian tải lượng virus thể hiện qua CT cũng khác nhau.
 
Xét nghiệm RT-PCR có thể phát hiện virus SARS-CoV-2 tại giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh (1-2 ngày trước khi có triệu chứng đầu tiên) và giai đoạn toàn phát bệnh. Do đó, xét nghiệm RT-PCR được xem là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán người mắc Covid-19. 

Hy vọng những kiến thức trên đây đã góp phần giúp bạn có cái nhìn đầy đủ về PCR là gì cũng như RT PCR là gì. Đồng thời hiểu được ý nghĩa của “CT” trong kết quả xét nghiệm virus Sar-Cov-2. 

Pacificlab rất vui khi có thể mang đến cho bạn nhiều kiến thức hơn nữa về kiểm nghiệm vi sinh vật nói chung và PCR nói riêng. Tìm hiểu thêm về PCR và các dịch vụ liên quan tới PCR mà chúng tôi cung cấp tại:
https://pacificlab.vn/vi/shops/group/real-time-pcr/

Nguồn tham khảo: 

Nguồn tham khảo: XÉT NGHIỆM PCR TRONG CHẨN ĐOÁN Y KHOA